检测硫代葡萄糖苷的原理
硫代葡萄糖苷有120多种类型，常见标品不多，如何利用HPLC检测不同类型的GS?
硫代葡萄糖苷的测定
（一）、分光光度法
一、原理：
GS在蔬菜中内源酶----芥子酶的作用下水解产生葡萄糖，用3,5—二硝基水杨酸
法测定所产生的葡萄糖量，计算出GS的含量。
二、仪器及试剂：
1、实验材料
(1)3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、氢氧化钠、苯酚、无水葡萄糖、氟化钠、醋酸铅、硫酸钠。
(2)市售大头菜、油菜、白萝卜
2、仪器
(1)722分光光度计；
(2)恒温水浴锅；
(3)电炉；
(4)刻度比色管；
(5)容量瓶；
(6)漏斗；
(7)研钵；
(8)温度计；
(9)砧板、菜刀。
三、实验步骤
1、标准曲线的制作
（1）3,5-二硝基水杨酸的配置
取酒石酸钾钠182g及用3,5-二硝基水杨酸7g，加热溶解于500mL蒸馏水中，加入15g氢氧化钠，溶解后再加4g苯酚及1g无水亚硫酸钠，溶解后定容至1000mL，放置一周后备用。
（2）葡萄糖标准溶液的配置
取0.100g无水葡萄糖，蒸馏水溶解并定容至100mL，此溶液每mL含葡萄糖1.0mg
（3）葡萄糖标准曲线的绘制
取6支10mL刻度试管，依次加入葡萄糖标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL,用蒸馏水补足至1mL，加入3,5-二硝基水杨酸溶液3mL混匀，于沸水浴中保温10min（使其完全反应）后取出，冷却至室温后定容至10.0mL，于530nm处测吸光度值，以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
2、样品的酶解
选取大头菜表皮、中间、中心部位，油菜的根、茎、叶部位，萝卜的表皮、中间、中心部位，准确称取研磨每种样品0.500g两份，分别置于两支25mL刻度试管中，各加氟化钠
0.1g。在一支试管中加沸水20mL,立即加热至沸并保持10min。在另一支试管中则加入35~38度蒸馏水20mL，置37度水浴中保温酶解1小时，使GS在芥子酶作用下水解。完成酶解后加热至沸并保持10min。
3、GS总量的测定
在两支试管中分别加入6滴中性醋酸铅，以沉淀其中的蛋白质及色素类物质，过量的醋酸铅应用饱和的硫酸钠溶液消除。最后，加蒸馏水定容至25mL，用滤纸过滤至试管中。取滤液各0.5，按葡萄糖标准曲线绘制方法，分别测定其吸光度。
四、GS总量的计算
GS=（m2-m1）×50×2.207／m×100％
式中: m1—灭酶管从标准曲线上查得的相应葡萄糖量，mg
m2—酶解管从标准曲线上查得的相应葡萄糖量，mg
m—样品质量，mg
2.207——是硫葡萄糖转化为硫葡萄糖苷的系数
五、误差分析
1、标准曲线的制作
绘制的标准曲线不过原点，可能是由于测量时参比溶液的配制不准确，引入了少
量影响光吸收物质。
2、硫代葡萄糖苷含量的测定
测定结果中，有的测定值不合理。可能是在样品研磨中并转移至比色瓶过程中，
由于研磨及在空气中停留时间过长，还有研磨时产生的热，使芥子酶作用于植物体，即
灭酶处理的样品在灭酶前有部分葡萄糖苷已被酶解，
缩小灭酶前后的差值及人为的偶然
误差引起。
（二）、气相色谱法
一、试剂DEAE-Sephadex A-25，Pharmacia进口分装；烯丙基硫甙，冰乙酸、醋酸铅、醋酸钡、乙腈、TMCS、吡啶均为AR，。
二、色谱分析条件
气相色谱采用氢焰离子化检测器；
3mm1.6m玻璃柱，2％OV-1或2％OV-7固定液，Chromosorb W AW DMCS担体（60-80目）；程序升温：初始温度190摄氏度，终止温度280摄氏度，升温速率3摄氏度/min；
进样口温度：300摄氏度；
载气流速：N2 30ml/min，H2 50ml/min，空气500ml/min。高效液相色谱采用紫外检测器，检测波长220nm；4mm*250mm不锈钢柱，柱内填充YWG-C18H37(10um)；
流动相为3％乙腈，流速2.5ml/min。
三、材料及样品的预处理和测定
1、DEAE-Sephadex A-25柱的制备：将5g DEAE-Sephadex A-25置于250ml烧杯中，加入50m1水，浸泡24小时以上备用。用玻璃纤维塞入8*150mm层析柱的底部，加入少量水于柱中，用滴管吸入少量浸泡好了的DEAE-Sephadex A-25，沿柱壁注入柱内，制成一个高约1mm的层析柱（相当于100mg），待水面快要接近柱面时，盖上塞子，以防水全部流干。
2、样品制备：准确称取脱脂样品0.200g于10m1离心管中，加沸水4ml，在沸水浴中提取5分钟。冷后加入内标烯丙基硫甙标准溶液1m1(1.5umo1/ml)，摇匀。加0.5ml浓度为
0.5mo1/L的Ba(Ac)2—Pb(Ac)2溶液，水浴上温热，稍冷后离心5分钟（3000r/min）。吸取上清液2.5m1放入DEAE-Sephadex A-25层析柱中，当柱子流干后，用2—5m1 0.02mol/L醋酸吡啶溶液洗涤一次，再用2—4ml水洗二次。加入lml 0.2％硫酸酯酶（H-1型），待近干时，塞紧塞子，放置过夜。每次用1ml水，连续淋洗色谱柱4次。将淋洗液合并，摇匀后供测定用。
3、气相色谱测定和结果的计算：取2ml制备液在80℃水浴锅中，用旋转蒸发器蒸干或
放在衍生管中，在100以下放有干燥硅胶的烘箱中烘干。加入吡啶100ul，BSTFA 1001
，TMCS 10ul。塞紧瓶塞，振动摇匀。在120℃保温20分钟，制备衍生物。取1ul按气相
色谱条件进样分析。
四、计算结果
(三)、高效液相色谱法
一、原理用70% 甲醇水溶液提取硫代葡萄糖苷，然后在阴离子交换树脂上纯化，并酶解脱去硫酸根，反相色谱柱分离，紫外检测器检测硫代葡萄糖苷。
二、试验材料
转基因油菜籽及其产品、受体油菜籽及其产品。如果对转基因油菜籽产品中的硫代
葡萄糖苷进行测定，转基因油菜籽产品和受体油菜籽产品的处理条件应相同。
三、仪器和试剂
仪器：
1、研钵或微型研磨机；
2、聚丙烯离子交换微柱：底部筛板为100目；
3、离心机：带有10 mL转头，并能获得5000 g的相对离心力；
4、0.45 μm水溶性微孔滤膜；
5、高效液相色谱仪：具备梯度洗脱，柱温可控制在30℃，带紫外检测器；
6、色谱柱：填料颗粒小于或等于10 m的反相C18或C8柱，例如：Novapak C18柱，5
m（150 mm×3.9 mm）；Lichrosorb Rp18柱，5 m（150 mm×4.6 mm）；Spherisorb C18柱，10 m（150 mm×4 mm）；Lichrospher Rp8柱，5 m（
125 mm×4 mm）。
试剂：
除非另有说明，仅使用分析纯试剂；水为蒸馏水。
1、硫酸酯酶溶液：Helix pomatia H1型（EC 3.1.6.1），每毫升硫酸酯酶溶液的活性单
位不低于0.5，硫酸酯酶溶液应即配即用。
2、葡聚糖凝胶悬浮液：称取10 g DEAE Sephadex A 25葡聚糖凝胶，浸泡在过量的2
mol/L醋酸溶液中，静置沉淀，再加入2 mol/L醋酸溶液，直到液体体积是沉淀体积的
2倍，于4℃冰箱中存放，待用。
3、70%甲醇溶液：取70 mL甲醇，加水定容至100 mL。
4、0.02 mol/L醋酸钠溶液：称取0.272 g醋酸钠（CH3COONa·3H2O），加入800 mL
水溶解，用醋酸调节溶液的pH值至4.0，加水定容至1 L。
5、6 mol/L甲酸咪唑溶液：称取204 g咪唑，溶解于113 mL甲酸中，待溶液冷却后加
水定容至500 mL。
6、内标：用丙烯基硫代葡萄糖苷（Mr=415.49）作内标，当样品中含有丙烯基硫代葡萄
糖苷时，用苯甲基硫代葡萄糖苷（Mr=447.52）作内标。对硫代葡萄糖苷含量低于20.0
mol/g的样品，可将下述中的内标溶液浓度降为1 mmol/L至3 mmol/L。内标溶液在4
℃的冰箱中可存放三周，在-18℃条件下可保存更长时间。
（1）5 mmol/L丙烯基硫代葡萄糖苷溶液：称取207.7 mg丙烯基硫代葡萄糖苷溶解于
80 mL水中，加水定容至100 mL。
（2）20 mmol/L丙烯基硫代葡萄糖苷溶液：称取831.0 mg丙烯基硫代葡萄糖苷溶解于
80 mL水中，加水定容至100 mL。
（3）5 mmol/L苯甲基硫代葡萄糖苷溶液：称取223.7 mg苯甲基硫代葡萄糖苷溶解于
8 0mL水中，加水定容至100 mL。
（4）20 mmol/L苯甲基硫代葡萄糖苷溶液：称取895.0 mg苯甲基硫代葡萄糖苷溶解于
80mL水中，加水定容至100 mL。
（5）流动相A：超声波脱气30s的水。
（6））流动相B：取200 mL色谱级乙腈，加入800 mL水，浑匀，超声波脱气30s。
四、操作步骤
（一）、试样的制备
如果试验材料的水分及挥发物含量超过10%，应在45℃条件下通风干燥，并将干燥后的
待测试样在微型粉碎机中粉碎，过40目筛，然后立即连续完成第四步的1和2。
（二）、称样：
分别称取200.0 mg待测试样至A、B两支离心管中。
（三）、硫代葡萄糖苷的提取
1、将离心管75℃水浴1 min，加入2 mL 70％沸甲醇溶液后，立即加入200 L 5 mmol/L内标溶液至A管中，200 L 20 mmol/L内标溶液至B管中。
2、75℃水浴10 min，其间每隔2 min取出离心管在旋涡混合器上旋涡混合，然后取出
离心管冷却至室温， 5000 g离心3 min，分别转移上清液至10 mL刻度试管A＇、B＇中。
3、分别向A、B管中再加入2 mL 70％沸甲醇溶液，75 ℃水浴约30 s，旋涡混匀后，75
℃水浴10 min，其间每隔2 min取出离心管旋涡混合，然后取出离心管冷却至室温，
5000 g离心3 min，分别转移上清液至原刻度试管A＇、B＇中。
4、用水调节A＇、B＇管中的提取液至5 mL，混匀。此提取液在-18 ℃暗处可保存2周。
（四）、离子交换微柱的制备
每一个试样提取液准备一支聚丙烯离子交换微柱，垂直置于试管架上。取0.5 mL充分混匀的葡聚糖凝胶悬浮液至每一离子交换微柱中，注意不要使悬浮液粘附在柱壁。静置待液体排干后，取2 mL 6 mol/L甲酸咪唑溶液冲洗树脂，排干后，再用1 mL水冲洗树脂两次，每次均让水排干。
（五）、色谱条件
仪器条件：流动相流速为1.0 mL/min，柱温30 ℃，紫外检测器检测波长229 nm，进样量10 L，记录峰面积。
五、结果表示
单组分硫代葡萄糖苷含量的计算：以每克干基脱脂油菜籽中所含硫代葡萄糖苷的微摩尔
数表示，
式中：
D1 －干基脱脂油菜籽中硫代葡萄糖苷含量，单位为微摩尔每克（mol/g）；
Ag —脱硫硫代葡萄糖苷峰面积；
As —内标峰面积；
Kg —脱硫硫代葡萄糖苷相对校正系数，
m —试样质量，单位为克（g）；
n —试样中加入内标的量，单位为微摩尔（mol）；
w —试样中水分、挥发物和含油量之和，以质量百分数表示（％）。
计算结果表示到小数点后两位。
硫代葡萄糖苷的检测_百度文库
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