蛋白粒子病中尚未解决的问题
设想方案
蛋白粒子病中尚未解决的问题
家蚕细小病毒样病毒Bombyx mori parvo-like virus(BmPlv)感染家蚕,并引发软化病。该病毒是造成夏秋季蚕茧减产的主要病原之一。BmPlv过去称为家蚕浓核病毒2型(BmDNV-2)。BmPLV无囊膜,衣壳呈二十面体对称结构。BmPLV与细小病毒比较有两个显著的特征:一是该病毒的基因组为两个单链DNA分子(VD1,VD2),并且这两个分子独立包装在不同衣壳中;二是基因组具有编码DNA聚合酶的结构域。病毒两部分基因组分别包装在不同衣壳中,这种特性在动物病毒中尚为首例。病毒结构蛋白的性质和组成决定了病毒衣壳结构及病毒粒子侵染特性。目前,家蚕细小病毒样病毒的结构蛋白性质和组成尚未确定。 本研究中,首先克隆了家蚕细小病毒样病毒(中国镇江株)vp基因,在大肠杆菌中进行了融合表达,制备VP蛋白多克隆抗体;其次,通过氯化铯密度梯度超速离心,对病蚕蚕粪中的病毒粒子进行纯化,由SDS-PAGE电泳对病毒结构蛋白进行分析,并应用Western bolt和质谱技术对病毒的结构蛋白进行鉴定。最后,对病毒vp基因进行真核表达。取得的研究成果如下: 1.原核表达病毒VP蛋白,制备多克隆抗体 克隆vp基因,构建了具有麦芽糖标签的重组表达载体pMAL-c2x-vp。 在大肠杆菌E.coli TB1菌株中,经终浓度1.0mmol/L IPTG 37℃诱导,表达融合蛋白MBP-VP。通过12%的SDS-PAGE电泳分析,在97.2kDa的位置有特异条带。这与融合蛋白MBP-VP的理论分子量97.5kDa基本一致。对特异蛋白条带的质谱鉴定,证明vp基因在大肠杆菌中进行了融合表达。用MBP-VP融合蛋白免疫大白兔,获得MBP-VP蛋白的抗血清,并经过蛋白A亲和层析柱纯化,获得了MBP-VP多克隆抗体。 2.家蚕细小病毒样病毒(中国镇江株)结构蛋白的鉴定 对病蚕蚕粪中的病毒粒子进行氯化铯密度梯度超速离心纯化,经透射电镜观察,病毒粒子纯度较高。病毒粒子经100℃高温变性,并通过10%的SDS-PAGE电泳分析,胶上显示主要有7条蛋白带,分别命名为P1-P7。分子量分布在32-133kDa之间。对胶上的蛋白分别用VP蛋白抗体和病毒粒子抗血清进行Western blot鉴定以及质谱鉴定。结果表明:P5,P6是病毒的主要结构蛋白,由VD1-ORF3编码。P7是病毒的次要结构蛋白,由VD2-ORF1编码。 3.在昆虫细胞Sf9中表达病毒VP蛋白 将vp基因连接到转移载体pFastBacHTb上,转化到大肠杆菌DH10Bac中,通过同源重组获得bacmid-vp,应用脂质体包埋的方法对Sf9细胞进行转染,产生重组病毒。将收获的重组病毒感染Sf9细胞,表达目的蛋白。并由Western blot鉴定,在结果中检测到两条蛋白带,推测分别是P5,P6。
朊蛋白是可传播性海绵状脑病病原体，是既有传染性又缺乏核酸的非病毒致病因子。PrP高度耐受高压消毒或福尔马林处理，须用特殊高压消毒程序或次氯酸钠（漂白粉）消毒。人类PrP由20号染色体短臂膀上面PRNQ基因编码，有两种异构体，分别是存在于正常细胞的PrPC和引起动物及人类朊蛋白病的PrPsc。良种异构体序列无差别，但蛋白空间构型不同，PrPc是一种细胞内膜结合蛋白，生物学功能不清；PrPsc不仅存在于细胞内膜，在细胞外淀粉样蛋白丝和斑块中也可发现，PrPsc可促进PrPc转化为PrPsc。人体内PrP增殖可能是一个PrPc分子与一个PrPsc分子结合，形成一个杂合二聚体或三聚体，此二聚体会转化成两个PrPsc分子，再依次呈指数增殖。PrP如何传播疾病迄今不明。人类朊蛋白病在约15%的患者为遗传性，均为常染色体显性遗传，患者家族也朊蛋白基因突变（人类命名为PRNP），机体对α－螺旋向β－片层转变特别易感，遇到外部致病因子（如PrPsc）时约半数人可发病，潜伏期长短与接触致病因子的量及不同构型毒株有关。