急!请教大神,请问测乙酰胆碱脂酶活时,一定要测蛋白浓度吗?
如果一定要测蛋白浓度,那么用BCA法好还是Lowry法好。我们要测的样本是鱼的肌肉、肝、脑等部位的酶活?
测定操作:
1.分光光度计预热30min,调节波长到412nm,蒸馏水调零。
2.试剂二置于37℃水浴中预热30min。
3. 空白管:取1mL玻璃比色皿,依次加入100μL蒸馏水、800μL试剂一、50μL 试剂二和50μL试剂三,迅速混匀,于412nm处测定3min内吸光值变化,第10s吸光值记为A1,第190s吸光值记为A2。△A空白管=A2-A1
4. 测定管:取1mL玻璃比色皿,依次加入100μL上清液、800μL试剂一、50μL 试剂二和50μL试剂三,,迅速混匀,于412nm处测定3min内吸光值变化,第10s吸光值记为A3,第190s吸光值记为A4。△A测定管=A4-A3
注意:空白管只需测定一次。
AchE活性计算公式:
1. 组织AchE活性
(1)按照蛋白浓度计算 活性单位定义:每毫克蛋白每分钟催化产生1nmolTNB的酶量为1个酶活单位。 AchE酶活(nmol/min/mgprot)=[(△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×109 ]÷(Cpr×V样)÷T =245×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr
(2)按照样本质量计算
活性单位定义:每克组织每分钟催化产生1nmolTNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min/g)=[(△A测定管-△A空白)÷ε÷d×V反总×109 ]÷(W×V样÷V http://www.solarbio.com 样总)÷T
=245×(△A测定管-△A空白管)÷W
2. 细菌、细胞AchE活性
活性单位定义:每104 个细胞每分钟催化产生1nmolTNB的酶量为1个酶活单位。AchE酶活(nmol/min/104 cell)=[(△A测定管-△A空白)÷ε÷d×V反总×109 ]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=245×(△A测定管-△A空白管)÷细胞数量
3. 血清AchE活性
活性单位定义:每毫升血清每分钟催化产生1nmolTNB的酶量为1个酶活单位。 AchE酶活(nmol/min/mL)=[(△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×109 ]÷×V样÷T=245×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr
ε:TNB摩尔消光系数,13.6×103 L/mol/cm;V反总:反应体系总体积(L),1mL=0.001L;106 :1mol=1×106 μmol;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:蛋白浓度(mg/mL);W:样本质量,g;V样:加入上清液体积(mL),0.1mL;T:反应时间(min),3min。